山南后期虽与伊东来往甚密，但跟随近藤勇多年，自己一直是受到“先生”的待遇，无论是冲田还是藤堂，都是带着一种憧憬和崇拜的眼光来看待自己。然而上洛以来近藤变得只信任土方一个，事事征求土方的意见，明明土方位居自己之下，却事事以他为重，自己的意见等等根本不被放在眼里，这让一直备受尊重的山南心里十分不平衡。不仅手中权力被土方夺走，自己又不被众人重视，空有一个“总长”头衔，这样的虚位要来何用？

　　“自己好歹也是个总长身份，但却处处不受重视，谏言也不被采纳；近藤事事听从土方馋言，这样的局长已不值得我与之同生共死。”
　　二月下旬的一天，山南留下了这样一封字条便消失了。
　　日期：2013-11-22 20:10:31
　　↑埋葬了山南敬助的光缘寺
　　三十二、山南敬助的切腹（后篇）
　　看到字条的土方立刻将此事报告给了近藤。这山南刚消失不久，说不准到底是有心逃走还是外出散心，也说不准他到底是会回来还是一去不返。而此时土方拿着山南留下的字条前去通知近藤的一幕被恰巧经过廊下的几名队士看见了。土方心中暗叫不妙，山南去向、去意皆不明，在找回山南之前此事绝不可以走漏风声。于是土方便严令那几个队士不准声张，并派出冲田总司出发前去寻找。
　　要问为什么要让冲田总司去追，其实这里面大有深意。能让近藤、土方、山南同时信任的，只有冲田。让他去追代表近藤土方不想把事情闹大，冲田可以说服山南并把他乖乖带回屯所，要是换其他人去追，山南万一拒捕，那便不是逃走也成了逃走了。
　　冲田骑上快马一路狂奔，不到一个时辰便到了离京都仅有十二公里的近江大津，毫不费力地就在大津宿找到了山南。
　　山南一见冲田的面，先是有些惊讶，然后突然明白了什么似的，露出一抹苦笑。
　　“总司，你怎么来了……”
　　“……”
　　当晚两人留在大津过夜，回到壬生村的前川邸已经是第二天中午的事了。
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　　乍一看此事好像是在近藤、土方的包庇之下成功大事化小，但第二天竟然传出了“山南敬助意图逃走，于前川邸被命令切腹”的消息。
　　这个爆炸性的消息一经散播，新撰组内部像炸开了锅一样。山南敬助身为新撰组总长，近期虽因伤无法参加任何行动，但局长近藤与副长土方好歹也是给他留下了一个总长的身份，待遇并未降低，他为何产生离队的念头？只消失了一夜，回来便要切腹，这其中到底有什么隐情？在大津宿的一夜到底发生了什么？
　　永仓新八与伊东甲子太郎第一时间赶到关押山南的房间，永仓一见到山南便毫不犹豫地迎上前去，“山南先生，接下来的事就交给在下吧，无论发生何事在下一力承担，请先生再次……逃离这里吧！”
　　听到“逃离”这个词，山南不由得再次苦笑了一下，摇了摇头：“多谢美意，但这次无论如何是逃不掉了。我已做好切腹的觉悟和准备，请无需挂心。”
　　过了一会，近藤、土方、冲田、斋藤等干部一个个地走了进来，在山南的面前站成了一排。
　　“新撰组总长——山南敬助因脱逃罪，触犯局中法度的‘有违武士道’一条，故命切腹。山南先生，介错人可以由您自行选择。”
　　这“介错人”的职责就是在切腹人进行切腹之后，由背后一刀砍下其首级，以达到减轻其痛楚的目的。
　　山南闻言，抬头向面前众人扫视了一圈。
　　“那么，就由总司来吧。”
　　被点到名的冲田极为惊讶，动了动嘴唇似乎想要说话，但还是忍住了。于是轻轻点了点头。这介错人本来就要由亲近的人担任，既然山南希望由自己来做，那么自己便责无旁贷。
　　山南换好正装，面不改色地端坐在中央的蒲团之上，向自己前方站成一排的、一直以来的试卫馆旧友们一一致谢，并以水代酒，与众人郑重地话别了一番。
　　在山南的要求下，介错人由冲田总司担当。
　　“在我示意之前，请不要下刀。”山南这样对冲田说道。
　　冲田点了点头，默默地看着山南使用短刀疾速在自己腹部划开一道“一”字，得到山南的示意之后，含着眼泪挥下了手中的刀……

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　　关于山南敬助切腹之谜，队中众队士皆是不明所以，连目送山南上路的各番队长们，事后也都是对此事守口如瓶，没有泄露半点风声。
　　山南的“脱逃事件”，本来可大可小。山南在试卫馆时期就跟随近藤勇左右，与其说是门生，不如说是友人。至于为什么近藤、土方会同意他切腹，恐怕还是因为山南在一连串的事件当中都与新撰组的两位最高领导人多次冲突，而且山南的勤王思想也与佐幕的土方近藤水火不容，这时候又与伊东一党走得太近，于是干脆就顺水推舟直接以脱逃罪让山南切腹，同时给伊东甲子太郎一个下马威：连山南敬助我们都杀了，要想活命你就老实点。显然伊东是理解了其中意思，虽后来作了首诗指桑骂槐地讽刺近藤，直到借了家茂去世的噩耗的光为止，在接下来的两年里确实也没敢轻举妄动。

　　山南切腹的第二天，就按照神道仪式举办了葬礼，并厚葬于壬生村光缘寺。与芹泽鸭不同，山南的葬礼是安静而且低调进行的，除了队中众队士外，光缘寺内还自发地聚集了许多附近的老百姓，由于山南的好人缘，这些町人在听说山南死讯之后第一时间赶往吊唁，只为送曾经敬爱的新撰组总长山南敬助走完最后一程。

　　翌月十日，新撰组正式将屯所移至西本愿寺北集会所。
　　日期：2013-11-22 20:14:03
　　下面贴上一些关于山南切腹的广泛流传的说法。
　　★山南患抑郁症一心求死说；（新撰组468队士大名鉴——壬生狼友会）
　　★无法发挥作用、失去立场消沉自杀说；（土方岁三新选组的组织人——相川司）
　　★未返回大津疗养地，被揪住小辫子强迫切腹说；（一番队长冲田总司的生涯——菊地明）
　　★以逃走博取重视失败说（新选组100话——铃木亨）
　　★与萨摩人大津密谋被冲田抢先带回说；（彻底检证新撰组之——「= =真的检证过么」加来耕三）
　　★反对屯所迁移悲愤自尽说（壬生浪士始末记——架空历史小说家、幕末最强脑补帝西村兼文）
　　日期：2013-11-23 21:23:32

　　↑西本愿寺境内
　　三十三、第二次组织编成
　　元治元年十二月，潜伏在博多的高杉晋助终于下定决心，与伊藤博文、石川小五郎率领力士队、游击队发动了功山寺武装政变，并成功将政权重新夺回长州激进派的手中。
　　庆应元年二月，长州已在激进派掌控之中，对外假意恭顺，内部则是以养精蓄锐、富国强兵为首要任务。英、美、法、荷四国联军在下关战争时展开的强大军事力量让高杉晋助彻底了解到，一味地实行攘夷已经是纸上谈兵、与时代脱节的想法了。倒不如与诸列强友好合作，学习他们的先进技术，并导入欧美最尖端的武器才能够从根本上解决日本落后的现状。而首先要做的，便是增强长州的军事力量，以达到对抗幕府的目的。