但是长州的异变始终是瞒不过幕府的耳目，对于长州的可疑举动，幕府做出了再次出兵对其进行讨伐的决定。
　　三月下旬，为迎接第二次长州征讨，新撰组需要扩充人手，便进行了第二次队士招聘。此时的招聘由土方岁三负责，并与斋藤一、伊东甲子太郎三人东下江户。此时的新撰组经过池田屋一役后声名大噪，不仅是京阪地区，就连在江户都是大名鼎鼎，众多浪士、武士都以加入这个号称“最强剑豪集团”的新撰组为荣。此次便成功获得队士五十四名，其中还包括近藤勇的表兄弟宫川信吉。

　　关于新屯所的问题，之前被要求借出境内用作新撰组屯所的西本愿寺方面，想尽了各种方法拒绝此事。先是将新撰组众位干部招待至京都有名的料亭享用美食，后又以寺内名义向新撰组“捐赠”贵重物品，笼络手段一个接着一个。但土方岁三是个性格倔强的人，逆反心理又重，他既心意已决，又岂会容许一点小小的贿赂就中断自己的计划。二月末，实在拗不过土方的西本愿寺门迹使田中主铃，向朝廷上表了公文，表示愿意借出境内作为新撰组新屯所使用。

　　幕府在经过了前一年的禁门之变、长州讨伐等事件中吸取了教训，将一直以来的军队训练体制由荷兰式改为法国式，佐幕的新撰组当然也响应幕府号召，按照法国式的标准来进行军事演练。
　　将屯所迁移至西本愿寺后，新撰组队士们立刻搬入了大炮、步枪等，迫不及待地就在西本愿寺的境内进行了炮击、枪击练习。这一练习不要紧，震耳欲聋的炮声将本堂屋顶的瓦片都给震了下来，不但把住持吓得够呛，就连前来参拜的信男信女也都被震得浑身发抖，怨声连连。住持实在看不下去，便好言相劝，希望停止境内炮击练习。可是只得到了一句“我们这是为了保卫国家正在进行操练。”这时一直游历于中国、九州的寺侍西村兼文结束行程返回到西本愿所，眼前看到的竟是这样的一幕。西村便立刻面见新撰组的上级——会津藩的公用方小森久太郎、野村左兵卫，向他们陈述了事情的经过。会津藩也认为此事不妥，于是传唤近藤前来，对他说：“在洛中练习炮击，爆炸的巨响会影响到御所的众贵人，还是收敛一些为妙。”

　　没办法，上级传话，不听也得听。但新撰组的众人心中不服，一个小小的寺侍，竟然越级擅自上告到会津藩，这也太不像话了。于是众干部找到住持大闹了一场。西本愿寺方面没办法，为了解决纠纷，又送了一些金银之物给新撰组充作活动资金，好不容易才成功安抚众人的情绪。
　　然而行军打仗，这炮击、枪击还是得练的。于是近藤、土方回到壬生村向壬生寺得到了许可，将新撰组的射击场移到了那里。

　　大炮在当时还是很稀罕的物件，很多百姓从来都未曾见过，因此每天早晨新撰组进行军事演习的时候，都会有一些百姓前往围观。而且壬生寺就在前屯所兼宿舍——八木邸的附近，来到壬生寺就像回到了家，很多队士们在屯所迁移的时候连随身衣物都没有带走，练习结束后也不立即返回，而是跑回八木邸以及其他一些相熟的百姓家中，吃饭、喝茶、叙旧等等，忙得是不亦乐乎。
　　此时新撰组总人数已达到134人，同期进行了第二次整体大改编。以“五人一伍长、十人一组长”的体制，将新撰组全体由一番队编至十番队。局长近藤勇、副长土方岁三、参谋伊东甲子太郎。各组长分别为：一番队组长冲田总司、二番队组长永仓新八、三番队组长斋藤一、四番队组长松原忠司、五番队组长武田观柳斋、六番队组长井上源三郎、七番队组长谷三十郎、八番队组长藤堂平助、九番队组长铃木三树三郎、十番队组长原田左之助。并设立18名伍长、7名监察役；任命冲田总司、永仓新八、斋藤一、池田小太郎、田中寅藏、新井忠雄、吉村贯一郎7人为剑术师范；松原忠司、筱原泰之进、梁田佐太郎3人为柔术师范；谷三十郎为枪术师范；安富才辅为马术师范、清原清、阿部十郎2人为炮术师范；武田观柳斋、尾形俊太郎、斯波雄藏、毛内监物4人为文学师范。

　　而被新任为参谋的伊东甲子太郎在这段时间里基本上是东奔西跑，为逮捕脱逃的队士，多次前往尾张、奈良等地进行追捕。一天突然接到从老家的妻子那里传来的飞脚急报，上书“母亲重病”。伊东大惊，赶忙告假连同胞弟铃木三树三郎一起快马赶回老家。谁知一进家门，原配妻子阿梅竟然笑意盈盈地出门相迎。伊东心中不快，我老母亲重病缠身，身为儿媳此时居然能像事不关己一样，真是失德。谁知这阿梅接下来的一句话差点闪折了伊东甲子太郎的老腰。

　　“夫君你虽为国事忙于奔波，但也得顾念家室啊。而且听闻那新撰组在京城到处掀起腥风血雨，妾身顾念夫君安危，于是只好撒个小谎，想让夫君你早日回家团聚而已。”
　　伊东一听差点口喷鲜血倒地。勃然大怒，颤抖地指着夫人就开始破口大骂，“好男儿志在四方，我为国事四处奔波操劳，你这贱人不但不全力支持，反倒撒谎咒我母亲重病，你，你……”
　　伊东“你”了半天，气得是好久都没缓过劲儿来。阿梅从未见过伊东发这么大脾气，站在一旁目瞪口呆。
　　既然知道“老母重病”乃是谣言，那就不能继续久留了。于是伊东携胞弟三树三郎即刻上路，临行前给夫人留了一张“三行半”，也就是休书，然后在夫人的嚎啕大哭之下，匆忙赶回新撰组屯所。

　　日期：2013-11-24 14:26:47
　　↑西本愿寺
　　三十四、将军暗杀事件
　　庆应元年闰五月，将军家茂由东海道西行，第三次上洛进行第二次长州征讨的准备工作。而途中的一个住宿点，就被选为了近江国（现滋贺县）的膳所藩。自二代藩主秀忠公以来，膳所藩已有二百五十年未曾接待过将军。此时的藩主为二十代本多康穰，接到老中水野忠精下达的命令后，便倾尽全藩上下之人力、财力，将二之丸御殿里里外外彻底重新装修，终于在家茂抵达的前几日竣工，并以最佳的状态准备迎接家茂的驾临。

　　可是突然从京都守护职处传达了“膳所藩内尊攘志士暗埋地雷，蓄谋暗杀将军，因此将将军宿泊地点临时改为大津宿”的通知。
　　消息一经传来，膳所藩上下是大惊失色。这膳所藩虽为石高只有6万石的小藩，但与近邻的彦根藩一样，持的都是佐幕思想。支持幕府的佐幕派居然爆出暗杀将军的丑闻，简直是岂有此理。但幕末的每个藩内都存在“佐幕”、“勤皇”两派，这膳所藩也不例外。其中最为过激的是河濑太宰，此人受到佩里来航时所带来的冲击，将增强海防建设作为急务向藩内提出改革建议，并向众藩士灌输“勤王倒幕”的思想，又帮助脱藩的藩士逃亡倒幕主力长州藩方面，成功培养了一批批倒幕志士。此期间新撰组与会津藩兵多次出动前往近江水口、大津等地，对可能逃亡在外的攘夷志士进行了追捕。闰五月中旬河濑被逮捕后，松平容保认定此人为极度的危险分子，择日便判了斩首之刑。