九月十六日晚正下着大雨，平山与平间搀着芹泽回到八木邸，在同一间大屋里中间只隔开一道屏风，左边是平山及桔梗屋的一个游女名叫吉荣，右边便是芹泽与阿梅，平间则是带了轮违屋的游女系里睡在别室。平山、吉荣、芹泽、阿梅四人的房间隔壁，便是八木源之丞一家人的寝室。半夜12时左右，土方岁三先行由玄关潜入，将四人所在的寝室窗子拉开一半，向里面偷窥了一会，确认四人已进入梦乡，便原路折回通风报信。随平山一同回到八木邸的游女吉荣真是命不该绝，正在实施暗杀行动的这个风口浪尖上起夜上厕所，刚来到院子里就碰上几名手持钢刀的蒙面人，当即吓得腿脚发软跌坐在地上。其中一蒙面人低声喝道，“快回家去，这里危险！”好不容易缓过神来的吉荣慌乱爬起，连鞋都忘了穿，一路狂奔逃出了八木邸。

　　准备工作都已做好，接下来就是实施行动了。山南、原田一组来到房间左侧平山处；土方、近藤、冲田一组来到房间右侧的芹泽处，两方人马几乎同时踢开房门，山南与原田组一刀便砍下了熟睡中的平山的脑袋。另一边，冲田先行打头阵，掀开被子就是一顿狂刺。虽说身上中了冲田一剑，芹泽鸭毕竟是神道无念流高手，应变奇快，当即操起枕边武器应战，从下方一刀斜刺过来划过冲田面颊。可怜阿梅连眼睛都没来得及睁开就死于乱刀之下。但芹泽此时面对的是天然理心流三大高手，转眼之间身上便多处挂彩，好不容易摸黑闯出房门撞撞跌跌地来到隔壁八木一家人的寝室，刚拉开房门便被门口小桌绊倒，被后方追来的土方一刀毙命。当时三人追砍芹泽时所留下的刀痕，至今仍清晰地留在八木邸母屋的门框之上。

　　由于天气闷热，八木家女主人本就睡不踏实，这会儿见这芹泽破门而入，又被后上的蒙面人斩杀滚倒在自己两个儿子的被褥之上，当即吓得魂飞九天，爬上前去拼命摇晃两个儿子试图将他们叫醒，但这两个孩子当时也不知中了什么邪，无论母亲如何摇晃自己身体，就是醒不过来。
　　另一边，睡在其他房间的平间重助这个不知死活的，听到刀剑相碰的声音便以为是萨长等攘夷志士潜入行刺，光着身子便从床上爬起抓起武器绕到院子里，大声喊道：“人呢？贼人现在何处？”喊了几声发觉不对，又依稀看到前方几条黑影攒动，看身形仿佛是土方岁三和冲田总司。于是心中暗道不好，芹泽与平山怕是已遭不测。情急之下也顾不得什么形象不形象，只穿了一条内裤便转身飞快逃离了八木邸。

　　事后，对外宣称此事乃是长州过激志士趁着夜黑风高潜入行刺，而会津藩高层也未加细查便接受了这个说法。凶案发生的第三天——九月十八日，在八木邸附近的壬生寺举行了芹泽与平山两队长的葬礼。芹泽头冲南、脚冲北；平山则是头冲北、脚冲南，二人皆以局长之礼被埋葬在壬生寺的新选组成员墓地。而八木邸月夜惨案的另一位死者——芹泽鸭的爱妾阿梅，一时间也因新选组其他队员要求之下差点葬入壬生寺与芹泽合棺，但被近藤坚决拒绝。“芹泽乃是局长之尊，无论如何不能跟这种来历不明不正经的女人葬在一起。”说完叫来阿梅的情夫菱屋太兵卫，要求他替阿梅收尸。可这太兵卫来是来了，在替阿梅收尸这件事上却是万般推阻。“既然阿梅已为贵局长生前妾室，那么她的遗体就该由贵方受取。”说罢也不管众人反应如何，自顾自地回去了。近藤等人没有办法，只好派人联系阿梅老家，请了好久之后，老家才来人不情不愿地把阿梅遗体领回去了。

　　日期：2013-11-04 11:40:36
　　十五、长州的间谍
　　安葬好芹泽与平山，这新选组便是近藤一人天下了。此时近藤为一把手局长，土方、山南仍然位居副长之职进行辅佐。此时近藤虽是翻身农奴把歌唱，但新选组全体却是面临着崩坏危机。
　　新见、芹泽、平山三人先后死去，平间重助逃走，芹泽一党实质上已然土崩瓦裂。余下的“前芹泽一党”，便面临着两个选择：要么逃走，要么归顺近藤。大部分的队士在逃与顺归之间左右摇摆，这段时期新选组内部人心涣散，情势极其不稳。九月二十三日，近藤老家发来信函，说是近藤养父近藤周斋病重，请近藤返乡探望。但这个节骨眼上近藤如何脱得了身，于是由会津方出面给近藤老家回复了一封信，拒绝了归乡的请求。

　　“前日新选组两位局长同时逝世，现局中事务全部由近藤先生一人打理，在这关键时刻近藤先生如果返乡，那么新选组势必会面临分崩离析的危机，现如今的状况近藤先生是一日都不能离开京都，无论如何请务必谅解。”
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　　然而新选组这些人显然深谙“识时务者为俊杰”的道理，犹豫了没多久就各自决定了今后的路。非试卫馆一派近四十人，仅有五、六人逃走，余下三十余人便向近藤靠拢，巩固了近藤的单独政权。
　　一波未平一波又起，九月二十六日又发生了一件大事。
　　长州的桂小五郎（后来的木户孝允）真可谓是不撞南墙不回头，他知道这新选组日益强大，越来越难对付，倒不如从先内部开始瓦解。于是派出四名长州的间谍潜入队中，准备刺探敌情伺机行动。于是在八月二十五日，御仓伊势武、荒木田左马之助、越后三郎、松井龟次郎这四名长州藩士就来到了新选组大本营壬生村。
　　近藤以自己招牌式的农民般纯朴气质和微笑，亲切热情地接见了四位长州人。此四人称自己本是长州藩士，但由于勤王攘夷问题与藩内起了冲突，于是脱藩想要加入新选组。近藤二话不说，立刻接纳四人入队，不仅为他们特设“国事探侦方”一职，连门限都不必遵守，还当即发下金一百两供四人开销及制作队服之用。然后叫来监察方岛田魁，告诉他这四人即日起加入新选组正式成为其中一员，让岛田带着他们在附近好好转转，熟悉熟悉路。

　　正当这四人心中感叹“近藤这家伙真好忽悠”的同时，近藤也在怀疑这些来历不明的长州人的真正目的。于是特地嘱咐众位干部，多加注意这四名浪士。

　　这四个长州人潜入新选组整一个月后发生的事情。九月二十五日，以上四名说要前往公卿大原三位邸，永仓新八与中村金吾便陪同前往。谁知这四个人一见有人前来搅局，便突然在中途改变路线，绕开大原邸直奔一个叫池龟的小料亭。几人进了料亭，叫了几样小菜便喝上了小酒。喝着喝着，永仓发现这四个长州人一个接一个地借故外出，好长时间都没回来。永仓觉得奇怪，悄悄地下楼挨个房间察看，发现其中一个房间里那四名长州人和八名彪形大汉正坐在一起密谋，永仓屏住呼吸听了一会，隐约听到自己的名字，和“暗杀”之类的字眼。永仓赶忙回到楼上，不大一会儿，这四个人也上来了。